使用 NCBI 在线 BLAST 进行序列比对

  • 如何进入 NCBI BLAST 网站、界面长什么样
  • 如何准备和粘贴示例序列
  • 关键参数（数据库、算法、E-value 等）具体含义
  • 如何阅读 BLAST 结果页面中的图形和表格
  • 根据不同研究目的如何调整参数

一、BLAST 与 NCBI 在线平台简介

1.1 什么是 BLAST？

BLAST（Basic Local Alignment Search Tool） 是一类用于“在数据库中查找与给定序列相似序列”的局部比对算法家族，常见变体包括：

  • BLASTN：核酸 vs 核酸
  • BLASTP：蛋白 vs 蛋白
  • BLASTX：核酸（翻译成蛋白）vs 蛋白
  • TBLASTN：蛋白 vs 翻译后的核酸库

BLAST 的典型应用包括：

  • 判断一个未知序列可能来自哪个物种、对应哪个基因或蛋白
  • 查找同源基因（ortholog/paralog）
  • 验证测序结果是否正确、是否被污染

1.2 NCBI 在线 BLAST 入口与界面

NCBI 提供了免费的在线 BLAST 服务，无需本地安装软件，只要有浏览器即可使用。

步骤 1：打开 NCBI 网站
在浏览器地址栏输入： 
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/
或在搜索引擎中搜索 “NCBI BLAST”，点击官方链接（通常标题为 “BLAST: Basic Local Alignment Search Tool”）。
步骤 2：认识 BLAST 首页
典型的 BLAST 首页包含几个大模块：
  • Nucleotide BLAST（核酸 BLAST）
  • Protein BLAST（蛋白 BLAST）
  • BLAST Assembled Genomes 等高级入口
本节主要使用 Nucleotide BLAST 和 Protein BLAST 两个入口。
NCBI BLAST 首页：Nucleotide BLAST 与 Protein BLAST 入口

二、准备示例序列

为演示流程，先给出两条简短的示例序列，可直接复制使用。

2.1 核酸序列示例（nt BLAST）

下面是一段来自人类线粒体基因组（COI 片段）的核酸序列，已用 FASTA 格式 标注好：

>Example_COI_human_mtDNA
ATGATTATGGAAGCTTCTAGGAGCCATCAAGTATTTAGCTGACTATGAACCCCCT
ACAAATCATTAATCGGAGGCTTTGGCAACTGACTAGTTCCCCTAATAATCGGAGG
CTTTGGAAACTGACTAGTCCCTCTAATAATCGGAGGCTTTGGCAACTGACTAGTT

说明：

  • 第一行以 > 开头的是序列 ID，可以任意命名
  • 后面几行是碱基序列，只包含 A/C/G/T（以及少量其他 IUPAC 碱基符号）

2.2 蛋白序列示例（protein BLAST）

下面是一条简化的蛋白氨基酸序列，同样是 FASTA 格式：

>Example_Protein
MALWMRLLPLLALLALWGPGPGAGGHEGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSL
YQLENYCN

说明：

  • 第一行以 > 开头的是蛋白 ID
  • 后面是氨基酸单字母码（A、R、N、D、...）

三、一步步完成核酸 BLAST（BLASTN）

3.1 打开 BLASTN 页面

  1. 访问 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/
  2. 在首页点击 Nucleotide BLAST 按钮，进入核酸 BLAST 页面。

进入页面后，可看到以下主要区域：

  • Enter Query Sequence：粘贴或上传核酸序列
  • Choose Search Set：选择比对的数据库和物种范围
  • Program Selection：选择 BLAST 算法模式（Highly similar sequences / Somewhat similar sequences）
  • Algorithm parameters：展开的高级参数区（Word size、Match/Mismatch scores 等）

3.2 粘贴序列与基本设置

在 Enter Query Sequence 区域进行如下操作：

  1. 将上文给出的核酸 FASTA 序列整体复制，粘贴到 “Enter Query Sequence” 的文本框中。
  2. 保持 Query subrange 为空（代表比对整条序列）。
  3. 如果有多个序列，可以继续往下粘贴，每条以 > 开头。

在 Choose Search Set 区域：

  • Database 建议初学者选择：nr/nt（Non-redundant nucleotide sequences）
  • Organism：
    • 如果已大致了解来源物种，可输入例如 “Homo sapiens (taxid:9606)”
    • 如果完全未知，建议先留空，搜索所有物种

3.3 重要参数说明

在 Program Selection 和 Algorithm parameters 部分，有一些关键参数值得理解：

Program Selection
一般会有类似选项：
  • Highly similar sequences (megablast)：适合比对高度相似的序列，例如不同样本同一物种
  • More dissimilar sequences (discontiguous megablast)：适合更远缘的同源性搜索
初学者若只是验证测序结果，多选 megablast 即可。
E-value（Expect value）
  • E-value 表示“在当前数据库大小下，随机出现同等或更好比对得分的期望次数”
  • 数值越小，说明该比对越不可能是随机产生的，可信度越高
  • 常见默认值为 10，对于高质量比对，可关注 E-value < 1e-5 或更小的 hits
Word size（词长）
  • BLAST 首先寻找长度为 word size 的完全匹配“种子”
  • word size 越小，敏感性越高，但速度更慢
  • 对较短或较不保守的序列，可以适当减小 word size 提高灵敏度
Match/Mismatch 与 Gap penalty
  • Match/Mismatch：匹配奖励与错配惩罚（如 +2/-3）
  • Gap costs：插入/缺失的开启动作和延长动作的惩罚
  • 默认设置通常已对大多数情况较为合理，一般无需修改

3.4 提交任务与运行过程

  1. 确认序列与参数设置无误后，点击页面下方的 BLAST 按钮。
  2. 页面会跳转到一个“搜索进行中”的等待界面，显示队列位置和预计剩余时间。
  3. 完成后会自动跳转到结果页面，包含多个标签页（Overview、Descriptions、Alignments、Graphics 等）。

四、一步步完成蛋白 BLAST（BLASTP）

4.1 打开 BLASTP 页面

  1. 同样访问 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/
  2. 在 BLAST 首页点击 Protein BLAST。

蛋白 BLAST 的页面结构与核酸 BLAST 非常类似，只是数据库和参数的默认设置稍有不同。

4.2 粘贴序列与参数设置

在 Enter Query Sequence 区域：

  1. 将上文给出的蛋白 FASTA 序列复制粘贴到文本框。
  2. 确认下方的 Query subrange 为空，表示使用全长蛋白。

在 Choose Search Set 中：

  • Database：建议选择 nr（Non-redundant protein sequences）
  • Organism：可留空，或填写预期物种（如 Homo sapiens）。

蛋白 BLAST 常见的额外参数：

  • Matrix（替换矩阵）：如 BLOSUM62、PAM30 等，决定不同氨基酸替换的得分
  • Comp. based stats：成分校正设置，一般保持默认

设置好后同样点击 BLAST 等待结果。

五、结果页面结构与解读

无论是核酸 BLAST 还是蛋白 BLAST，结果页面结构非常类似，主要包含以下几个关键部分。

5.1 图形概览（Graphic Summary）

通常位于结果页面靠上的 “Graphic Summary” 区域，用彩色条带展示：

  • 横轴：查询序列（Query），从 5' 到 3'（或 N 端到 C 端）
  • 每一条彩色横线：一个数据库匹配（Hit）的局部比对位置
  • 颜色深浅：代表得分高低（Score），颜色越深表示匹配质量越高
BLAST 结果页：Graphic Summary（图形概览）标签页
Graphic Summary：以彩色条带概览各条 Hit 在 Query 上的比对位置与得分分布。

解读要点：

  • 如果在整条 Query 上都能看到一条长而连续的深色条，说明有高度相似的同源序列存在
  • 如果只在局部有短片段比对，可能对应保守结构域或局部保守区域

5.2 匹配列表（Descriptions）

在 “Descriptions” 或 “Sequences producing significant alignments” 表格中，常见列包括：

  • Description：匹配序列的注释信息（基因名、物种、功能描述等）
  • Max score / Total score：比对得分，数值越大表示比对越好
  • Query cover：查询序列中被覆盖的比例（%）
  • E value：显著性指标，数值越小越可信
  • Per. Ident：身份性（Identity）比例，即完全匹配的碱基/氨基酸比例
BLAST 结果页：Descriptions（匹配列表）标签页
Descriptions：按显著性排序展示 hits，并提供 Query cover、E value、Identity 等关键指标。

一般经验：

  • E-value < 1e-5 且 Per. Ident > 80%，通常可以认为是比较可靠的同源关系（具体阈值依研究而定）
  • Query cover 较低但 Identity 很高时，说明只是局部高度保守

5.3 比对详情（Alignments）

点击某一条 Hit，可以看到具体的序列比对：

  • Query：查询序列
  • Subject：数据库中的匹配序列
  • 中间一行的符号：
    • |：完全相同
    • +：相近/保守替换（蛋白）
    • 空格或其他：错配或 gap
  • Identities：完全匹配的碱基/氨基酸数量及比例
  • Gaps：插入/缺失的数量

通过该区域可以直观判断：

  • 是否存在大片段连续匹配
  • 是否有大量 gap 或集中错配区域
BLAST 结果页：Alignments（比对详情）标签页
Alignments：展示 Query 与 Subject 的逐位比对，可用于定位错配、缺失/插入与局部保守区域。

结果页的 “Taxonomy” 标签用于按物种谱系汇总 hits，便于快速判断匹配序列的物种分布与潜在污染来源。

BLAST 结果页：Taxonomy（物种分类）标签页
Taxonomy：按谱系层级统计 hits，可用于查看命中结果在不同类群中的分布情况。

5.4 如何下载与分享结果

在结果页面通常可以看到：

  • Download 按钮：支持下载为 TSV、XML、FASTA 等多种格式，以便本地保存或进一步分析
  • Send to：可将结果发送到文件、本地计算机、或保存到 NCBI 账号
  • Request ID（RID）：一个唯一的任务 ID，可以在一定时间内用来重新访问结果

六、常见问题与实战小技巧

6.1 常见报错与处理

  • 提交后很久没有结果：
    • 可能是数据库选择过大（如 nr）且序列较长，耐心等待
    • 可尝试限制 Organism 或选择更小的数据库加快速度
  • 提示序列格式错误：
    • 检查是否包含非法字符（如中文、空格、特殊符号）
    • 确保 FASTA ID 行以 > 开头，后面不要再有 > 或 HTML 符号
  • 结果为空或只有很差的匹配：
    • 确认序列方向、是否含有大量 N（不确定碱基）
    • 适当提高 E-value 阈值或减小 word size

6.2 如何根据研究目的调整参数

不同研究问题对 BLAST 的参数需求不同，可参考下表思路：

验证测序结果/物种鉴定
  • Program：Highly similar sequences (megablast)
  • E-value：默认或更严格，如 1e-10
  • Database：nr/nt 或针对目标物种数据库
寻找远缘同源基因/蛋白
  • Program：More dissimilar sequences 或使用 BLASTX/PSI-BLAST
  • 适当提高 E-value 阈值以捕获更多远缘 hits
  • 适当减小 word size 提高敏感性
功能预测与结构域分析
  • 推荐以蛋白序列为 Query，使用 BLASTP
  • 多关注 Descriptions 中的功能注释和保守结构域
  • 可结合 CDD（Conserved Domain Database）进行结构域扫描

完成本节练习后，可：

  • 熟练打开 NCBI 在线 BLAST 平台，并选择合适的 BLAST 类型
  • 用 FASTA 格式准备并提交核酸/蛋白序列
  • 理解并调整常用参数（数据库、Organism、E-value、Program 等）
  • 读懂 BLAST 结果中的图形概览、匹配列表和比对详情

建议在实际工作中多尝试不同的序列与参数组合，逐渐形成适合研究方向的 BLAST 使用习惯。

© 南京中医药大学 人工智能与信息技术学院 袁少勋