单细胞数据分析（Seurat）

1. Seurat 简介

Seurat 是 R 语言中用于单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）数据分析的主流工具包，由 Satija Lab 开发并维护。它覆盖从原始表达矩阵到细胞分群、细胞类型注释、差异表达与可视化的完整流程。

• 主要功能：质控（QC）、归一化、高变基因筛选、降维（PCA、UMAP、t-SNE）、聚类、细胞类型注释、差异表达与 Marker 基因、多样本整合等。
• 适用数据：10X Genomics、Smart-seq2 等平台产生的基因×细胞表达矩阵（count 或 TPM 等）。
• 官方资源：Seurat 官网、PBMC3k 教程、GitHub。

2. Seurat 对象与数据结构

所有数据与中间结果都存放在一个 Seurat 对象 中。对象内包含：

• Assays：通常包含 RNA assay。其中 counts 为原始 count，data 为归一化后的表达，scale.data 为标准化后用于降维的高变基因矩阵。
• Meta data：每个细胞的注释信息，如 nCount_RNA（总 UMI）、nFeature_RNA（检测到的基因数）、percent.mt（线粒体基因占比）、seurat_clusters（聚类结果）等。
• Reductions：降维结果，如 pca、umap、tsne，用于后续绘图与聚类。

3. Seurat 示例数据说明

Seurat 官方教程常用 PBMC 3K 作为示例数据集，便于在本地快速复现完整流程。

3.1 数据来源与获取

• 名称：PBMC 3K（Peripheral Blood Mononuclear Cells，外周血单核细胞）。
• 平台：10X Genomics，Illumina NextSeq 500 测序。
• 规模：约 2,700 个细胞，约 13,714 个基因（hg19）。
• 获取方式：
  1. 从 10X 官网下载 CellRanger 输出的 filtered_gene_bc_matrices，用 Read10X() + CreateSeuratObject() 创建对象；
  2. 或使用 SeuratData 包安装 pbmc3k 后直接加载（InstallData("pbmc3k")，data("pbmc3k")）。

3.2 示例数据包含的细胞类型

经过聚类与注释后，PBMC 3K 中通常可区分出多种免疫细胞类型，例如：

• Naive CD4+ T、Memory CD4+ T、CD8+ T、NK、CD14+ Mono、FCGR3A+ Mono、B、DC 等。

教程会演示如何从原始矩阵得到这些细胞类型标签及对应的 Marker 基因。

4. 标准分析流程概览

使用 Seurat 做单细胞分析时，典型步骤包括：

1. 创建对象：CreateSeuratObject()，并（可选）计算 percent.mt。
2. 质控：按 nFeature_RNA、nCount_RNA、percent.mt 过滤低质量细胞。
3. 归一化：NormalizeData()（默认 LogNormalize）。
4. 高变基因：FindVariableFeatures()。
5. 标准化：ScaleData()（用于 PCA 的基因）。
6. 降维：RunPCA() → RunUMAP() / RunTSNE()。
7. 聚类：FindNeighbors() + FindClusters()。
8. 注释与可视化：根据 Marker 注释细胞类型，并绘制各类图。

5. 常用图形类型与解读

下面按“质控 → 降维/分群 → 基因表达 → Marker/差异”顺序，说明 Seurat 中常用图的含义与对应函数。

5.1 质控相关图

5.2 降维与分群图

5.3 基因表达图

5.4 差异与 Marker 图

上述图中，DimPlot、FeaturePlot、VlnPlot、DotPlot、DoHeatmap 是 Seurat 教程中最常出现的五类图，分别对应：分群展示、基因在空间上的表达、基因在各群分布、多基因多群对比、Marker 热图。

6. 可复制粘贴的 Seurat 示例代码

每一小节为「一段说明 + 一段代码」，按顺序复制到 R 中运行即可。建议先在 RStudio 中新建项目（见 6.0），再完成 6.1 环境与数据，最后按 6.2～6.5 做质控、流程、出图。

6.0 在 RStudio 中新建项目

新建项目便于统一管理脚本、数据和结果，且每次打开项目即进入对应工作目录。项目名称建议与本次分析相关，例如 seurat-pbmc（Seurat + PBMC 示例）或 single-cell-seurat。

1. 打开 RStudio，菜单栏选择 File → New Project…。
2. 选择 New Directory，再选 New Project。
3. Directory name 填写：seurat-pbmc（或 single-cell-seurat）；Create project as subdirectory of 选择你想保存的父文件夹，点击 Create Project。

创建完成后，RStudio 会打开该项目，工作目录即为该文件夹。后续可将 R 脚本保存于此，运行时代码中的相对路径均相对于该目录。

6.1 环境与数据

6.1.1 安装 Seurat（使用国内 CRAN 镜像加速）

先设置 CRAN 为国内镜像（如清华），再安装 Seurat，可显著加快下载。只需在首次使用或更新包时执行。

options(repos = c(CRAN = "https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/CRAN/"))
install.packages("Seurat")

6.1.2 安装 SeuratData 与示例数据集 pbmc3k

SeuratData 提供官方示例数据。先从 GitHub 安装 SeuratData 包，再下载 pbmc3k 数据集（约 2,700 细胞）。若 GitHub 较慢，可多试几次或配置网络。

if (!requireNamespace("remotes", quietly = TRUE)) install.packages("remotes")
remotes::install_github("satijalab/seurat-data")

library(SeuratData)
InstallData("pbmc3k")

6.1.3 加载包

每次打开 R 做单细胞分析前，先加载 Seurat 与 SeuratData。

library(Seurat)
library(SeuratData)

6.1.4 加载示例数据并赋给变量

将内置的 pbmc3k 数据载入内存，并统一用 pbmc 作为对象名。若出现 “Please run UpdateSeuratObject on your object”，说明对象是旧版 Seurat 格式，需运行 UpdateSeuratObject(pbmc) 转为当前版本后再继续。

data("pbmc3k")
pbmc <- pbmc3k
pbmc <- UpdateSeuratObject(pbmc)

6.1.5 计算线粒体基因比例（percent.mt）

pbmc3k 的 meta 里默认没有 percent.mt，需要先算出来，后面的质控小提琴图才能画三张（含线粒体比例）。线粒体基因名通常以 MT- 开头。

pbmc[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-")

6.2 质控

6.2.1 质控小提琴图（基因数、UMI 数、线粒体比例）

查看每个细胞检测到的基因数、总 UMI 数、线粒体基因占比的分布，用于设定过滤阈值或发现异常样本。若只有两幅图、提示 variables were not found: percent.mt，请先运行上面 6.1.5 计算 percent.mt。

VlnPlot(pbmc, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"), ncol = 3)

结果解读：可据此观察基因数、UMI 数、线粒体比例的分布范围与离群点，从而设定质控阈值（如 nFeature_RNA 200–2500、percent.mt < 5%）并过滤低质量细胞。

6.2.2 质控散点图（nCount vs nFeature）

看总 UMI 与检测基因数的相关性；离群点可能是双细胞或破损细胞。

FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "nFeature_RNA")

结果解读：nCount 与 nFeature 通常呈正相关；若出现明显偏离主云团的点，可能是双细胞或破损细胞，应在质控时剔除。

6.3 标准分析流程

6.3.1 归一化

对 raw count 做对数归一化，使细胞间可比。默认方法为 LogNormalize。

pbmc <- NormalizeData(pbmc)

6.3.2 识别高变基因

筛选在细胞间变异较大的基因，用于后续降维与聚类，默认取 2000 个。

pbmc <- FindVariableFeatures(pbmc, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)

6.3.3 标准化（Scale）

对高变基因做中心化与缩放，得到 scale.data，供 PCA 使用。

pbmc <- ScaleData(pbmc)

6.3.4 主成分分析（PCA）

在高变基因的 scale 矩阵上做 PCA，得到低维表示。后续用前若干主成分做聚类与 UMAP。

pbmc <- RunPCA(pbmc, features = VariableFeatures(object = pbmc))

6.3.5 构建邻接图并聚类

基于前 10 个主成分构建 KNN 图，再用 Louvain 等算法得到细胞聚类标签（seurat_clusters）。resolution 越大簇越多。

pbmc <- FindNeighbors(pbmc, dims = 1:10)
pbmc <- FindClusters(pbmc, resolution = 0.5)

6.3.6 UMAP 降维

在 PCA 基础上计算 UMAP 二维坐标，用于可视化分群与基因表达。

pbmc <- RunUMAP(pbmc, dims = 1:10)

6.4 可视化

6.4.1 分群图（UMAP 上按 cluster 着色）

在 UMAP 空间中展示各聚类，每点一个细胞，颜色为 seurat_clusters。

DimPlot(pbmc, reduction = "umap", group.by = "seurat_clusters")

结果解读：不同颜色代表不同 cluster，可直观看出细胞在 UMAP 空间中的分群是否清晰、是否有过度分裂或合并，为后续细胞类型注释提供空间依据。

6.4.2 基因在 UMAP 上的表达（FeaturePlot）

在 UMAP 上用颜色表示指定基因的表达量，用于判断该基因在哪些细胞/区域高表达。

FeaturePlot(pbmc, features = c("CD3D", "CD14", "MS4A1"))

结果解读：CD3D 高表达区对应 T 细胞群，CD14 高表达区对应单核细胞群，MS4A1 高表达区对应 B 细胞群，可与分群图结合判断各 cluster 的细胞类型。

6.4.3 按 cluster 的基因表达小提琴图

按聚类展示某基因的表达分布，比较不同群之间的表达差异。

VlnPlot(pbmc, features = "CD3D", group.by = "seurat_clusters")

结果解读：CD3D 在部分 cluster 中明显高表达、在其余 cluster 中较低，可帮助确认哪些 cluster 为 T 细胞相关，并评估 Marker 的特异性。

6.4.4 脊线图

与小提琴图类似，以脊线形式展示各群中某基因的表达分布。

RidgePlot(pbmc, features = "CD3D", group.by = "seurat_clusters")

结果解读：脊线峰的位置与高度反映各 cluster 中 CD3D 表达水平，便于在多群并排时快速比较 T 细胞相关 cluster 与其他群的差异。

6.5 差异基因与 Marker 图

6.5.1 为每个 cluster 找 Marker 基因

对每个聚类做差异表达，得到该群相对其他群高表达的基因（只保留正标记、满足最小表达比例与 logFC 阈值）。

markers <- FindAllMarkers(pbmc, only.pos = TRUE, min.pct = 0.25, logfc.threshold = 0.25)

6.5.2 每群取 top 10 基因（base R）

按 cluster 和 avg_log2FC 排序，每个 cluster 保留前 10 个基因，供 DotPlot/DoHeatmap 使用。

top10 <- markers[order(markers$cluster, -markers$avg_log2FC), ]
top10 <- do.call(rbind, lapply(split(top10, top10$cluster), head, 10))
top_genes <- unique(top10$gene)

6.5.3 点图（DotPlot）

横轴为基因、纵轴为 cluster；点大小表示表达比例，颜色表示平均表达量，便于对比多基因在多群中的表达。

DotPlot(pbmc, features = top_genes) + RotatedAxis()

结果解读：点大且颜色深的基因在该 cluster 中表达比例高、平均表达强，可据此快速识别各群的特征 Marker，辅助细胞类型命名与验证。

6.5.4 Marker 热图（DoHeatmap）

对上述 top 基因做热图，行是基因、列是细胞（按 cluster 排列），展示各群特征表达模式。

DoHeatmap(pbmc, features = top_genes, size = 3)

结果解读：每列为一个细胞、每行为一个 Marker 基因，颜色表示标准化表达；可看出各 cluster 对应的基因表达模式，用于确认分群与注释是否合理。